患者信息：

　　姓名：李先生

　　性別：男

　　年齡：28

　　患病信息：懷疑是患了生殖器皰疹但不知道是不是，請問患了此病應(yīng)該如何診斷?

　　針對以上描述，專家為您解答如下：

　　一、細(xì)胞學(xué)方法

　　對皮損刮片做Wright-Gemsa (Tzanck試驗)或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特征的巨細(xì)胞包函體，但不能區(qū)別HSV感染或水痘-帶狀皰疹病毒感染，敏感性僅為病毒分離的60%。

　　二、培養(yǎng)法

　　從水皰底部取材做組織培養(yǎng)分離病毒，為目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術(shù)條件要求高，價格昂貴，不能普遍使用。

　　三、抗體檢測

　　目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區(qū)分HSV-1和HSV-2的優(yōu)點。

　　四、基因診斷

　　(一)用PCR分型檢測單純皰疹病毒

　　PCR是一種敏感性高，特異性強(qiáng)的快速檢測方法，標(biāo)本中含有1fg HSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發(fā)展較快，且分型檢測HSV是發(fā)展的趨勢。

　　1、標(biāo)本采集和處理

　　(1)標(biāo)本采集

　?、倌X脊液：直接無菌采取患者0.5ml腦脊液標(biāo)本于無菌試管送檢.如肉眼可見血色，應(yīng)離心取上清。

　?、谘蛩皨雰貉? 同上，應(yīng)避免溶血.

　?、勰X組織: 腦組織尸檢、活檢標(biāo)本， 加1ml PBS標(biāo)本緩沖液研磨后，待檢。

　　④眼及皮膚病灶分泌物：用預(yù)測(半干)棉拭子直接取患處分泌物， 置1ml PBS標(biāo)本緩沖液中送檢。

　?、萆称?宮頸、陰道、外陰、陰莖)標(biāo)本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預(yù)潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1ml PBS標(biāo)本緩沖液中送檢。

　　(2)標(biāo)本處理

　?、兕A(yù)處理：所有液體標(biāo)本均可直接進(jìn)行模板制備;可以取100μl標(biāo)本液，離心5000 r/ minX5min后，去上清，取沉淀物進(jìn)行模板制備。

　?、谀０逯苽洌?/p>

　　a: 蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1 h后，煮沸10 min，離心5000 r/ minX5min，收集上清。

　　b: 水煮法：沉淀物加100μl蒸餾水，搖均水煮20 min，離心5000 r/ minX5min收集上清。

　　c: 1%Triton X-100裂解法:取采集的標(biāo)本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ minX5min，收集上清。

　　d: 5%NP-40裂解法：取采集的標(biāo)本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ minX5min收集上清。e: 如標(biāo)本溶血嚴(yán)重經(jīng)上述裂解處理后，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μl DW溶解待檢。

　　2、PCR擴(kuò)增

　　(1)引物設(shè)計。以HSV DNA聚合酶的高保守區(qū)為檢測靶序列以確保特異性。設(shè)計3個引物，一個上游共同性引物，DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′)：

　　二個下游特異性引物，DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　)和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′)，可以分別擴(kuò)增出HSV-1 469bp DNA片段(1981～2359)、HSV-2 391bp片段(1561～1953)：從二型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中設(shè)計了一個不分型的特異性探針HSVP3 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。

　　(2)PCR實驗體系。取模板10μl： DNAP5 0.5(0.2μmol/L)：DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L)：4XdNTP 8μl(4X200μmol/L)：10XdNTP 8μl(4X200μmol/L);10X緩沖液10μl：DMSO 4μl;加DW 65.5μl; 石蠟油 30μl.。

　　水煮(96℃～100℃)7min

　　加TaqDNA聚合酶1μl;(2.5U)

　　72℃4 min 　　↓

　　95℃40s 　　↓,

　　65℃60s → 72℃70s 　　↓

　　33個循環(huán)

　　70℃4 min

　　3.擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析

　　(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加樣品緩沖液4μl混勻后，點樣于2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠(EB)染色5min，于紫外燈下觀察結(jié)果在溴酚藍(lán)后面有一條或二條亮紅帶為陽性結(jié)果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在后，無帶則為陰性結(jié)果。

　　(2)XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產(chǎn)物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產(chǎn)生46bp片段帶(引物后面);與正常PCR產(chǎn)物比較，XhoI酶切后的大片段電泳位置前移。

　　(3)Southern印跡法：PCR產(chǎn)物20μl經(jīng)電泳分離后，用變性液處理60min，再用中和液處理90 min，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2 h，42℃預(yù)雜交(雜交液中)30 min， 加入32p標(biāo)記HSVP3探針后，42℃雜交過夜;次日用1%SDS/ PBS pH7.2， 42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2， 42℃洗15min; 膜置X線暗盒內(nèi)放射性自顯影12～15h， 顯影為陽性， 不顯影為陰性。